Pemeriksaan Enterobacteriaceace

Metode analisa enterobacteriaceae ini merupakan metode yang merujuk pada ISO 21528-2.

Peralatan:
1. Autoclave.
2. Inkubator.
3. Cawan petri terbuat dari gelas atau plastic dengan diameter 90 mm.
4. Loops berdiameter ± 3 mm, kawat dari bahan krom atau bahan steril lain yang dapat dibuang.
5. Pipet dengan kapasitas 1 ml.
6. Water bath yang dapat beroperasi pada suhu 44°C- 47°C.
7. Tabung atau botol dengan kapasitas maksimal 500 ml.
8. Stomacher
9. Spiritus.
10. Timbangan.

Bahan/ media:
1. Maximum recovery diluents.
2. Violet red bile glucose (VRBG) agar.
3. Nutrient Agar.
4. Glucose Agar.
5. Oxidase Reagent.

Carakerja:
1. Campurkan 180 ml diluents dengan 20 gram sampel yang akan diuji ke dalam plastic steril, lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik (pengenceran 10^-1). Ambil 1 ml suspensi dari pengenceran sebelumnya masukkan ke dalam tabung, campurkan ke dalamnya diluents sebanyak 9 ml, kocok hingga merata (pengenceran 10^-2).
2. Ambil dua cawan petri steril. Pindahkan 1 ml (pengenceran 10^-1) dengan pipet steril ke dalam cawan. Ambil cawan petri steril lainnya. Pindahkan 1 ml pengenceran 10^-2 dengan pipet steril lainnya.
3. Tuangkan sekitar 10 ml Violet red bile glucose (VRBG) agar (44°C hingga 47°C) ke dalam setiap cawan petri. Lama waktu antara inokulasi dan saat ketika media dituangkan ke cawan petri tidak akan boleh melebihi 15 menit. Campurkan inokulum dengan media dengan memutar cawan Petri secara hati-hati dan biarkan campuran memadat dengan meninggalkan cawan Petri berdiri pada permukaan horizontal dingin.
4. Setelah pemadatan sempurna, tambahkan 15 ml Violet red bile glucose (VRBG) agar, kemudian didinginkan. Balikkan cawan petri dan simpan dalam inkubator pada suhu 37°C selama 24 jam ± 2 jam. Jangan menumpuk cawan petri lebih dari enam cawan. Tumpukan cawan petri harus dipisahkan dari satu sama lain dan dari dinding dan atas inkubator.
5. Indentifikasi karakteristik koloni yang berwarna pink ke merah atau ungu (dengan atau tanpa presipitasi halo). Pilih cawan petri yang mengandung kurang dari 150 koloni karakteristik, hitung koloni ini. Kemudian pilih secara acak lima koloni tersebut untuk subkultur untuk tes konfirmasi biokimia. Enterobacteriaceae tertentu dapat menyebabkan penghilangan warna koloni mereka atau medium. Apabila tidak ada koloni karakteristik yang hadir, pilih lima koloni putih untuk konfirmasi.
6. Subkultur koloni pilihan dengan menggores media nutrient agar dengan koloni yang dipilih untuk konfirmasi. Inkubasi kultur pada suhu 37°C selama 24 jam ± 2 jam.
7. Konfirmasi biokimia:
a). Uji reagen oksidase
Ambil sebagian koloni kultur pada media nutrient agar dengan menggunakan loop atau kawat, gunakan oksidase kit. Hasil uji negatif ketika warna kertas filter tidak berubah menjadi gelap dalam 10 detik.
b). Uji fermentasi
Ambil koloni koloni kultur pada media nutrient agar yang sama dengan yang digunakan untuk uji reagen oksidase, inokulasikan pada tabung berisi glucose agar. Inkubasi dalam incubator pada 37°C selama 24 jam ± 2 jam. Jika terjadi perubahan warna kuning ke seluruh isi tabung, maka reaksidianggap positif.
8. Interprestasi uji biokimia.
Koloni yang menunjukkan negatif pada reaksi reagen oksidase dan positif pada reaksi glikosa dianggap sebagai Enterobactericeae.
9. Setelah selesai melakukan konfirmasi, limbah sisa dikumpulkan di satu kantung plastik dan disterilkan di dalam autoclave 121°C selama 15 menit.