Teknik aseptik dasar

INOKULASI DAN TATA aseptik LAINNYA

poin penting
Ada beberapa tindakan pencegahan penting yang harus diambil selama prosedur inokulasi untuk mengontrol peluang bagi kontaminasi kultur , orang atau lingkungan .
• Praktikum tdak dapat dimulai sampai semua persyaratan dalam jangkauan langsung dan harus diselesaikan sebagai secepat mungkin .
• Kapal harus terbuka untuk jumlah waktu minimum yang mungkin dan sementara mereka terbuka semua pekerjaan harus dilakukan dekat pembakar api Bunsen mana arus udara yang ditarik ke atas.
• Pada dibuka , leher tabung reaksi atau botol harus segera hangat oleh menyala sehingga udara apapun Gerakan adalah keluar dan kapal diadakan sedekat mungkin dengan horizontal.
• Selama manipulasi yang melibatkan cawan Petri , paparan permukaan dalam steril untuk kontaminasi dari udara harus terbatas pada minimum absolut .
• Bagian dari pipet steril yang akan dimasukkan ke dalam kultur atau pembuluh steril tidak harus disentuh atau dibiarkan datang dalam kontak dengan permukaan yang tidak steril lainnya , misalnya pakaian, permukaan wilayah kerja , di luar testabung / botol .

Menggunakan kawat loop
Loop kawat disterilisasi menggunakan panas merah dalam api Bunsen sebelum dan setelah digunakan . Mereka harus dipanaskan sampai merah panas untuk memastikan bahwa setiap mencemari spora bakteri dihancurkan . Gagang loop kawat diadakan dekat dengan restoran, seperti yang akan Anda pena , pada sudut yang hampir vertikal. Ini meninggalkan jari kelingking bebas untuk mengambil memegang kapaswol steker / sekrup tutup tabung / botol tes .

Flaming prosedur
Prosedur menyala dirancang untuk memanaskan akhir loop secara bertahap karena setelah digunakan akan berisi kultur , yang mungkin " tersedak " pada pemanasan cepat dengan kemungkinan melepaskan partikel kecil kultur dan aerosol formasi.
1 . Posisi pegangan ujung kawat dalam kerucut cahaya biru dari nyala api . Ini adalah daerah dingin api .
2 . Gambarkan sisa kawat ke atas perlahan-lahan sampai ke daerah terpanas api , ( tepat di atas kerucut biru muda) .
3 . Tahan ada sampai panas merah .
4 . Pastikan panjang penuh kawat menerima pemanasan yang memadai .
5 . Biarkan dingin kemudian gunakan segera.
6 . Jangan menaruh loop bawah atau gelombang sekitar.

petunjuk
Jika lingkaran tidak tahan cairan apapun loop belum membuat lingkaran lengkap. Untuk memperbaiki masalah ini, pertama memastikan bahwa loop telah disterilkan dan kemudian membentuk lingkaran dengan forsep. Jangan gunakan jari Anda karena kemungkinan menusuk kulit.

Menggunakan pipet
Steril lulus atau menjatuhkan ( Pasteur ) pipet yang digunakan untuk mentransfer kultur , media yang steril dan solusi steril .
1 . Lepaskan pipet dari wadah / wrapper pada akhir yang berisi wol steker kapas, merawat untuk menyentuh tidak lebih dari jumlah yang diperlukan untuk mengambil suatu pegangan yang kuat .
2 . Fit dot .
3 . Pegang pipet barel seperti yang Anda lakukan pena tetapi tidak memahami dot .
Jari kelingking dibiarkan bebas untuk mengambil terus dari kapas steker / tutup tabung reaksi / botol dan jempol untuk mengontrol dot .
4 . Tekan dot hati-hati dan mengambil sejumlah cairan yang cukup untuk jumlah yang diperlukan tetapi tidak mencapai dan basah wol steker kapas .
5 . Mengembalikan kelebihan apapun lembut jika volume diukur diperlukan .
Pipet tip harus tetap di bawah permukaan cairan saat mengambil cairan untuk menghindari pengenalan gelembung udara yang dapat menyebabkan " meludah " dan, akibatnya , pembentukan aerosol ketika cairan dikeluarkan.
6 . Segera menempatkan pipet sekarang terkontaminasi ke dalam panci membuang terdekat disinfektan . Dot tidak boleh dihapus sampai pipet berada dalam pot membuang dinyatakan tetes kultur akan mencemari permukaan kerja.

petunjuk
Sebuah pipet bocor disebabkan oleh salah satu dot rusak atau tidak pas atau serat dari wol steker kapas antara dot dan pipet .Menjatuhkan A ( Pasteur ) pipet dapat dikonversi untuk memberikan volume diukur dengan melampirkan ke sebuah steril jarum suntik barel pipa karet .

Flaming leher botol dan tabung reaksi
1. Longgarkan tutup botol sehingga dapat dihapus dengan mudah.
2. Angkat botol / tabung reaksi dengan tangan kiri.
3. Lepaskan tutup botol / kapas pasang dengan jari kelingking tangan kanan. (Putar botol, tidak tutupnya.)
4. Jangan meletakkan tutup / kapas plug.
5. Flame leher botol / tabung reaksi dengan melewati leher ke depan dan belakang melalui api Bunsen panas.
6. Pasang tutup pada botol / kapas pasang menggunakan jari kelingking. (Putar botol, tidak tutup.)
petunjuk Label tabung dan botol dalam posisi yang tidak akan terkikis selama penanganan. Entah spidol atau perekat diri label yang cocok. Kadang kapas plugs sengaja terbakar. Memadamkan api dengan segera menutupi dengan kering kain, bukan dengan meniup atau berendam dalam air. Inokulasi media dalam botol tutup dan tabung biasanya dilakukan oleh lingkaran.

Streak plate.
Loop digunakan untuk mempersiapkan streak plate . Ini melibatkan pengenceran progresif inokulum bakteri atau ragi di atas permukaan media agar dipadatkan dalam cawan Petri sedemikian rupa bahwa koloni tumbuh dengan baik dipisahkan darisatu sama lain.
Tujuan dari prosedur ini adalah untuk mendapatkan koloni murni tunggal yang terisolasi.
1 . Kendurkan bagian atas botol berisi inokulum.
2 . Pegang lingkaran di tangan kanan.
3 . Api loop dan biarkan dingin.
4 . Angkat botol / tabung reaksi yang berisi inokulum dengan tangan kiri.
5 . Lepaskan tutup / kapas steker dari botol / tabung reaksi dengan jari kelingking tangan kiri.
6 . Flame leher botol / tabung reaksi.
7 . Masukkan loop ke dalam kaldu kultur dan menarik.
Pada setiap waktu , terus loop sebagai masih mungkin.
8 . Api leher botol / tabung reaksi.
9 . Ganti tutup / kapas steker pada botol / tabung reaksi menggunakan jari kelingking . Tempat botol / tabung uji pada bangku.
10 . Sebagian mengangkat tutup cawan Petri yang berisi media padat.
11 . Pegang dibebankan lingkaran paralel dengan permukaan agar-agar , smear inokulum belakang dan ke depan di area kecil menengah (lihat diagram 1 melesat luas = A ).
12 . Hapus loop dan menutup cawan Petri.
13 . Api loop dan biarkan dingin . Memutar piringan melalui 90 º berlawanan arah jarum jam.
14 . Dengan didinginkan lingkaran beruntun piring dari daerah A di seluruh permukaan agar-agar dalam tiga garis paralel ( ke B lihat diagram 2 ). Pastikan bahwa sejumlah kecil kultur dibawa.
15 . Hapus loop dan menutup cawan Petri .
16 . Api loop dan biarkan dingin . Memutar piringan melalui 90 º berlawanan arah jarum jam lagi dan beruntun dari B di permukaan agar-agar dalam tiga garis paralel ( ke C see diagram 3 ).
17 . Hapus loop dan menutup cawan Petri.
18 . Api loop dan biarkan dingin . Memutar piringan melalui 90 º lingkaran berlawanan arah jarum jam dan beruntun di permukaan agar-agar dari C ke pusat piring ( untuk D lihat diagram 3 ).
19 . Hapus loop dan menutup cawan Petri . Api loop.
20 . Seal dan menetaskan piring dalam posisi terbalik .petunjuk Label setengah dari piring yang berisi media , penggunaan singkatan dan menjaga mereka ke tepi piring agar tidak mengganggu pengamatan kemudian koloni . Hal yang sama berlaku untuk menuangkan dan piring penyebaran dijelaskan di bawah ini . Entah spidol atau label perekat diri yang cocok .

Ada dua pendekatan untuk membuat streak plate : ( 1 ) dengan dasar ( berisi media ) ditempatkan pada permukaan kerja , mengangkat tutup vertikal (yaitu masih menutupi dasar ) paling sedikit yang akan memungkinkan akses dari loop , (2 ) dengan tutup ditempatkan pada permukaan kerja , angkat dasar , invert dan menyuntik ke atas - menghadap permukaan agar-agar . Metode kedua adalah terbaik disediakan untuk siswa yang lebih tua bekerja di debu dan draft- bebas laboratorium yang relatif , itu adalah salah satu yang digunakan oleh profesional mikrobiologi .
Inokulasi cair nutrisi botol agar didinginkan.
1 . Angkat cair nutrisi botol agar didinginkan.
2 . Lepaskan tutup dari botol agar nutrisi cair dengan jari kelingking tangan kanan yang masih memegang bermuatan pipet . Jangan meletakkan tutupnya.
3 . Flame leher botol.
4 . Masukkan pipet ke dalam botol dan dengan lembut melepaskan jumlah yang diperlukan tetes inokulum keagar. 5 . Flame leher botol dan mengganti tutupnya.
6 . Masukan pipet ke dalam panci buang. Hapus dot sementara pipet menunjuk ke disinfektan.

Teknik tuang / pour plate 1 . Gulung botol lembut antara tangan untuk mencampur kultur dan menengah secara menyeluruh . Hindari membuat udara gelembung.
2 . Pegang botol di tangan kiri , melepas tutup dengan jari kelingking tangan kanan.
3 . Flame leher botol.
4 . Angkat tutup cawan Petri sedikit dengan tangan kanan dan tuangkan campuran ke dalam cawan Petri dan mengganti tutupnya.
5 . Flame leher botol dan mengganti tutupnya.
6 . Lembut memutar piring untuk memastikan bahwa media mencakup piring merata.
7 . Biarkan piring untuk memperkuat.
8 . Seal dan menetaskan piring dalam posisi terbalik . ( Dasar piring harus ditutupi , agar tidak harus menyentuh tutup piring dan permukaan harus halus tanpa gelembung ).

Menuangkan media diinokulasi
petunjuk
Jika pipet tidak tersedia maka loop kawat dapat digunakan. Beberapa loopfuls kultur harus ditambahkan ke didinginkan agar nutrisi cair untuk memastikan bahwa ada cukup inokulum hadir untuk pertumbuhan.

Menggunakan sebuah spreader
Penyebar steril digunakan untuk mendistribusikan inokulum atas permukaan sudah menyiapkan pelat agar . petunjuk
Dianjurkan untuk menggunakan piring agar-agar yang memiliki permukaan sumur kering sehingga mengering inokulum cepat. keringkan permukaan pelat agar dengan baik menginkubasi piring selama beberapa jam , misalnya semalam, sebelumnya atau meletakkan mereka dalam oven udara panas ( ca 55-60 º C ) selama 30-60 menit dengan dua bagian terpisah dan permukaan bagian diarahkan ke bawah.
Penyebar kaca dibungkus dapat disterilisasi dalam oven udara panas (lihat " Media , Sterilisasi dan Desinfektan) . Mereka juga dapat disterilkan dengan menyala dengan alkohol.
Sterilisasi menggunakan alkohol
1 . Celupkan ujung bawah spreader ke dalam volume kecil 70 % alkohol yang terkandung dalam bejana dengan tutup (baik topi sekrup atau aluminium foil ).
2 . Berlalu dengan cepat melalui burner api Bunsen untuk menyalakan alkohol , alkohol akan membakar dan mensterilkan kaca.
3 . Hapus spreader dari nyala api dan biarkan alkohol untuk membakar.
4 . Jangan menaruh spreader di bangku.

petunjuk
Pastikan bahwa penyebar yang mengarah ke bawah padahal dan setelah memicu alkohol untuk menghindari pembakaran sendiri. Jauhkan gelas alkohol jauh dari api Bunsen.
penyebaran pelat
Penyebaran piring , juga dikenal sebagai piring rumput , harus menghasilkan kultur merata di atas permukaan pertumbuhan media . Ini berarti bahwa mereka dapat digunakan untuk menguji sensitivitas bakteri terhadap banyak zat antimikroba , untuk Contoh obat kumur , bawang putih , desinfektan dan antibiotik . Penyebaran plat dapat digunakan untuk pekerjaan kuantitatif ( jumlah koloni ) jika inokulum adalah volume terukur , biasanya 0,1 cm3 , dari masing-masing seri pengenceran , disampaikan oleh pipet.
1 . Longgarkan tutup botol yang mengandung kultur kaldu.
2 . Pegang pipet steril di tangan kanan dan botol / tabung reaksi yang berisi kultur kaldu di sebelah kiri.
3 . Lepaskan tutup / pasang dari botol / tabung reaksi dengan jari kelingking tangan kanan dan api leher.
4 . Dengan pipet , menghapus sejumlah kecil kaldu.
5 . Flame leher botol / tabung reaksi dan mengganti tutup / pasang.
6 . Dengan tangan kiri , sebagian mengangkat tutup cawan Petri yang berisi media nutrisi padat.
7 . Tempatkan beberapa tetes kultur ke permukaan sekitar 0,1 cm3 ( ca 5 tetes , cukup untuk menutupi sepotong 5 sen ).
8 . Ganti tutup cawan Petri.
9 . Tempatkan pipet dalam stoples buang.
10 . Celupkan penyebar kaca menjadi alkohol , api dan biarkan alkohol untuk membakar.
11 . Angkat tutup cawan Petri untuk memungkinkan masuknya penyebar.
12 . Tempatkan penyebar pada permukaan agar diinokulasi dan memutar piringan dengan tangan kiri memindahkan spreader di atas-ke- bawah atau gerakan sisi ke sisi untuk menyebarkan inokulum atas permukaan agar-agar. Pastikan seluruh permukaan agar-agar tertutup. Operasi ini harus dilakukan dengan cepat untuk meminimalkan resiko kontaminasi.
13 . Ganti tutup cawan Petri.
14 . Api penyebar menggunakan alkohol.
15 . Biarkan inokulum kering.
16 . Seal dan menetaskan piring dalam posisi terbalik.

petunjuk
Pertimbangkan drop dikalibrasi ( Miles dan Misra ) metode untuk menghitung koloni kultur murni bakteri danragi sebagai metode yang lebih ekonomis daripada pour plate dan pelat menyebar . Prosedurnya adalah sebagai untuk menyebarkan piring piring tapi sedikit diperlukan karena : ( 1 ) inokulum disampaikan sebagai tetes dari pipet menjatuhkan yang dikalibrasi (dengan diameter luar ujung) untuk memberikan tetes volume diukur misalnya 0,02 cm ³ , (2 ) banyak tetes ( enam atau lebih ) dapat diletakkan di satu piring . Metode ini tidak cocok untuk digunakan dengan kultur yang menghasilkan menyebarkan pertumbuhan termasuk kultur campuran dalam banyak sampel alam seperti tanah meskipun yoghurt dan keju adalah salah satu pengecualian .

Bekerja Aman di Laboratorium Mikrobiologi

Microbiology Safety Rules

Ada beberapa hal tertentu yang mesti kita perhatikan (dalam bekerja di sebuah laboratorium) yang dapat menyebabkan resiko bahaya, bahaya pada lab kimia akan berbeda dengan lab mikrobiologi bahkan boleh jadi resiko bahaya di lab mikrobiologi lebih besar dari resiko bahaya di lab kimia. analis yang bekerja didalam labmikrobiologi mungkin bisa terinfeksi atau terkontaminasi oleh kultur bakteri saat isolasi, selain itu ada juga bahaya tambahan dari reagen kimia yang digunakan. ada beberapa kasus yang telah terdokumentasikan(tercatat) bahwa ada tenaga laboratorium yang tertular penyakit (terkontaminasi) akibat pekerjaan mereka. Sekitar 20% dari kasus tersebut telah dikaitkan dengan insiden lain, tapi selebihnya dikaitkan dengan kesalahan keamanan saat bekerja praktek di laboratorium mikrobiologi. Ada kemungkinan bahwa kita (analis) bisa terkontaminasi mikroba yang berpotensi membahayakan ketika kita (analis) mengisolasi bakteri dari sampel lingkungan. jadi kita harus berasumsi (beranggapan) bahwa sample yang diambil dari lingkungan berpotensi berbahaya karena mengandung bakteri pathogen.

Sebuah laboratorium mikrobiologi adalah lingkungan yang unik yang memerlukan praktik khusus dan fasilitas keamanan (safety) yang baik untuk melindungi orang-orang yang bekerja dengan mikroorganisme. Keselamatan di laboratorium adalah perhatian utama. Tiga unsur utama keamanan (safety) terhadap kontaminasi mikroorganisme (1) teknik praktikum laboratorium yang baik dan benar, (2) peralatan keselamatan, dan (3) desain fasilitas.

Aturan Keamanan (safety rules) saat praktikum di Laboratorium mikrobiologi

1. Cuci tangan dengan sabun disinfektan ketika masuk ke laboratorium dan lakukan lagi sebelum meninggalkan laboratorium.
2. Tidak diperkenankan makanan, minum, permen karet, maupun merokok di laboratorium. Jangan menaruh apapun di mulut anda seperti pensil, pena, label, atau jari. Tidak menyimpan makanan di daerah mana mikroorganisme disimpan.
3. Menggunakan jas lab atau kemeja lengan panjang yang kancingnya tertutup. Pakainan tersebut (jas Lab) harus menutupi lengan dan dapat dilepas tanpa menariknya keatas kepala.
4. Kenakan sepatu khusus (sandal jepit tidak diperbolehkan) di laboratorium, sepatu tersebut tidak boleh digunakan untuk keluar laboratorium.
5. Jaga ruang kerja bebas dari semua bahan yang tidak perlu. Ransel, dompet, dan mantel harus ditempatkan dalam rak-rak kecil atau loker diluar laboratorium.
6. Mendisinfeksi area kerja sebelum dan sesudah digunakan dengan etanol 70% atau klorin 10%. Peralatan laboratorium dan permukaan kerja harus didekontaminasi dengan disinfektan yang tepat secara rutin, dan terutama setelah tumpahan, cipratan, maupun kontaminasi lainnya.
7. Berilabel segalanya dengan jelas.
8. Kencangkan tutup pada reagen, botol solusi, dan kultur bakteri. Jangan membuka cawan Petri (yang berisi kultur) di dalam laboratorium kecuali benar-benar diperlukan.
9. Inokulasi loop dan jarum (ose) harus disterilkan dalam api (pembakar) Bunsen sebelum disimpan. 10. Matikan pembakar Bunsen bila tidak digunakan.
11. Jika menggunakan Bunsen dengan bahan bakar sepirtus atau alkohol, pastikan tidak ada kertas dibawah atau didekatnya.
12. Perlakukan semua mikroorganisme sebagai patogen potensial. Gunakan peralatan dan alat pelindung diri yang tepat dan tidak membawa kultur keluar dari laboratorium.
13. Kenakan sarung tangan sekali pakai saat bekerja dengan mikroba yang berpotensi menular atau mengkontaminasi (misalnya sampel limbah).
14. Seterilkan peralatan dan bahan yang akan digunakan.
15.
Jangan pipet melalui mulut. Gunakan bantuan bulub atau pipettors volume disesuaikan. [Di masa lalu, beberapa personel laboratorium diajarkan memipet dengan mulut. Praktek ini telah menyebabkan banyak personil (analis) laboratorium terinfeksi. Dengan tersedianya perangkat pipetting mekanik, memipet dengan mulut sangat dilarang.]







16. Pertimbangkan segalanya Biohazard. Tidak menuangkan sesuatu ke dalam wastafel, seperti media kaldu / broth. kultur dalam media broth atau media agar harus didesturksi/disterilkan terlebih dahulu menggunakan autoklaf sebelum dibuang
17. Masukan semua materi sampah dalam kantong biohazard dan autoklaf sebelum dibuang dalam tempat sampah biasa.
18. Mengetahui lokasi atau tempat peralatan keselamatan di laboratorium (misalnya, shower pencuci mata , shower, wastafel, pemadam kebakaran, kabinet keamanan biologis, pertolongan pertama, katup gas darurat, dll).
19. Buang pecahan kaca dalam wadah kaca yang pecah.

Cara menagani tumpahan kutur mikroba

1. Gunakan jas lab, sarung tangan dan masker sekali pakai, dan juga alat pelindung diri yang sesuai.
2. Rendam handuk kertas atau tisu dengan cairan desinfektan yang sesuai seperti etanol 70% atau chlorine 10%, setelah itu letakan atau taruh disekitar tumpahan kemudaian biarkan/diamkan selama 10 menit (waktu kontak desinfektan).
3.Bersihkan tumpahan dengancara mengelap dari bagian/sisi luar ke bagian/sisi dalam. Pastikan untuk mendesinfeksi daerah dekat tumpahan.
4. Masukan semua handuk kertas atau tisu (yang tadi telah digunakan) dan juga sarung tangan beserta masker kedalam kantung Biohazard dan autoklaf bahan-bahan tersebut untuk disterilkan.
5. Lepas (ganti) jas Lab untuk didesinfeksi.