Peralatan:
1. Autoclave
2. Oven
3. Incubator
4. Water bath
5. Loop
6. Tabung reaksi
7. Pipet
8. Cawan petri
9. Timbangan
10. Spiritus
11. Sendok steril
Bahan/ media:
1. Buffered peptone water (BPW)
2. Rappaport-Vassilliadis medium with soya (RVS broth)
3. Muller-Kauffmann tetrathionate novobiocin broth (MKTTn broth)
4. Xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar)
5. Briliant green agar (BGA)
6. Nutrient agar
7. Triple sugar/ iron agar (TSI agar)
8. Urea agar (Christensen)
9. L-lysine decarboxylation medium
10. Reagent detection of β-galactosidase
11. Reagent for voges-proskauer (VP) reaction
12. Reagent indole reaction
13. Semi-solid nutrient agar
14. Physiological saline solution
Langkah kerja:
1. Campurkan 225 ml BPW dengan 25 gram sampel uji di plastic steril. Lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik. Inkubasi dalam incubator selama 18 jam ± 2 jam pada suhu 37oC ± 1oC.
2. Pindahkan 0,1 ml kultur dengan BPW ke dalam tabung berisi 10 ml RVS broth. Inkubasi dalam incubator pada suhu 41,5oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam. Pindahkan 1 ml kultur dengan BPW ke dalam tabung berisi MKTTn broth. Inkubasi dalam incubator pada suhu 37oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam.
3. Setelah masa inkubasi, inokulasikan kultur dengan RVS broth pada 2 cawan petri berisi XLD agar dan 2 cawan petri berisi BGA agar.
4. Inokulasikan kultur dengan MKTTn broth pada 2 cawan petri berisi XLD agar dan 2 cawan petri berisi BGA. 5. Balikan semua cawan petri. Inkubasikan cawan perti berisi media XLD dengan suhu 37oC selama 24 jam ± 3 jam dan cawan petri berisi BGA dengan suhu 35oC selama 18-24 jam.
6. Setelah waktu inkubasi, periksa cawan petri untuk kehadiran Salmonella atau koloni lain. Koloni Salmonella yang tumbuh di XLD agar memiliki pusat hitam dan zona transparan ringan kemerah-merahan.
* Salmonella paratyphi A yang tumbuh di XLD berwarna pink dengan pusat pink gelap sedangkan Lactose-positif Salmonella berwarna kuning denga atau tanpa pengelapan.
7. Koloni Salmonella yang tumbuh pada BGA berwarna merah/ pink/ putih buram dikelilingi dengan zona merah.
8. Untuk melakukan konfirmasi, inokulasi koloni yang dicurigai sebagai Salmonella yang tumbuh pada media XLD maupun BGA masing-masing pada Nutrient agar. Inkubasi pada suhu 37oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam.
9. Lakukan konfirmasi biokimia:
- Inokulasikan koloni kultur pada media Nutrient agar pada TSI agar. Inkubasi pada suhu 37oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam.
Interpretasi dari hasil yang muncul:
Pada dasar
kuning = Glukosa (+) (digunakan)
merah/ tidak berubah = glukosa (-) (tidak digunakan)
hitam = pembentukan hidrogen sulfide
gelembung/ retakan = pembentukan gas dari glukosa
Pada area miring
kuning = (+) sukrosa/ laktosa
merah/ tidak berubah = (-) sukrosa/ laktosa
*Kultur Salmonella menunjukkan warna merah pada area miring dan kuning dengan pembentukan gelembung dan gas hidrogen sulfide (agar menjadi mengelap).
*Lactose-positif Salmonella menunjukkan warna kuning pada area miring.
- Inokulasikan kultur pada media Nutrient agar pada area miring. Inkubasi pada suhu 37oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam.
Jika reaksi positif, terjadi pemisahan urea dan ammonia sehingga terjadi perubahan warna phenol dari merah ke pink, dan kelamaan menjadi merah ceri. Reaksi umunya muncul setelah 2-4 jam.
- Inokulasikan kultur pada media Nutrient agar pada L-lysine decarboxylation medium. Inkubasi pada suhu 37oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan kekeruhan dan warna ungu, sedangkan reaksi negatif fitunjukkan dengan warna kuning.
- Pindah kultur pada media Nutrient agar ke dalam tabung berisi 0,25 ml larutan saline dengan menggunakan loop. Tambahkan 1 tetes toluene dan kocok tabung. Simpan tabung dalam water bath dengan suhu 37oC selama ± 5 menit. Tambahkan 0.25 ml reagent β-galatosidase dan kocok. Simpan tabung di dalam water bath dengan suhu 37oC selama 24 jam ± 3 jam. Reaksi positif ditandai dengan munculnya warna kuning, reaksi muncul setelah 20 menit.
- Pindah kultur pada media Nutrient agar ke dalam tabung berisi 3 ml VP medium. Inkubasi pada suhu 37oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam. Tambahkan 2 tetes larutan creatine, 3 tetes larutan ethanolic 1-naphtol, dan 2 tetes larutan potassium hydroxide, kocok setiap penambahan setiap reagen. Reaksi positif dalam waktu 15 menit ditandai dengan pembentukan warna merah atau merah terang.
- Inokulasikan kultur pada media Nutrient agar pada tabung berisi 5 ml tryptone. Inkubasi pada suhu 37oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam. Setelah inkubasi, tambahkan 1 ml reagen kovacs. Reaksi positif ditandai dengan pembentukan cincin merah, sedangkan reaksi negatif ditandai dengan pembentukan cincin kuning kecoklatan.
- Dari serangkaian data reaksi uji konfirmasi, interpretasi dapat dilihat pada tabel di bawah ini:
10. Lakukan konfirmasi serological:
- Eliminasi auto-agglutinable strains: Teteskan 1 tetes larutan saline ke slide kaca yang telah dibersihkan dengan hati-hati. Tambahkan di tetesan tersebut menggunakan loop, bagian dari koloni yang akan diuji. Aduk dengan lembut selama 30-60 detik. Amati hasil dengan latar belakang gelap, sebaiknya dengan bantuan kaca pembesar. Jika bakteri telah mengelompok menjadi satuan, koloni dianggap mengalami auto-agglutinable, dan tidak perlu dilakukan tes berikut karena deteksi antigen tidak berhasil.
- Pemeriksaan O-antigen: Teteskan 1 tetes anti-O serum ke slide kaca yang telah dibersihkan dengan hati-hati, ambil satu koloni murni yang non-autoagglutinating, dengan menggunakan loop. Aduk dengan lembut selama 30-60 detik. Jika aglutinasi terjadi, reaksi dianggap positif.
- Pemeriksaan antigen Vi: Teteskan 1 tetes serum anti-Vi ke slide kaca yang telah dibersihkan dengan hati-hati, ambil satu koloni murni yang non-autoagglutinating, dengan menggunakan loop. Aduk dengen lembut selama 30-60 detik. Jika aglutinasi terjadi, reaksi dianggap positif.
- Pemeriksaan antigen H: Inokulasi koloni murni yang non-auto-agglutinable pada semi-solid nutrient agar. Inkubasi pada suhu 37 ° C ± 1 ° C selama 24 jam ± 3 jam. Gunakan kultur ini untuk pemeriksaan untuk antigen H, dengen meneteskan 1 tetes serum antigen H ke slide kaca yang telah dibersihkan dengan hati-hati, ambil satu koloni murni yang non-autoagglutinating, dengan menggunakan loop. Aduk dengan lembut selama 30-60 detik. Jika aglutinasi terjadi, reaksi dianggap positif.
- Interpretasi dari reaksi biokimia dan serologic
Tidak ada komentar:
Posting Komentar